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石蜡包埋(石蜡切片免疫组化)

时间:2021-06-13 01:47:53来源:黄埔信息网

石蜡包埋(石蜡切片免疫组化)石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

1、组织的采集、固定和保存:

采取组织后,

方法一:4%多聚甲醛(4%PFA)4°C 固定1小时(根据组织大小和致密程度调整固定时间)或过夜

方法二:采用bouin’s固定RT 2h(6-8d tesis)or RT 过夜(成年 tesis)

PBS缓冲液洗三次,每次5min,4°C保存于70%乙醇中。

2、组织的包埋、切片、展片及保存::

固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,52-54°C石蜡包埋,常规切片,切片厚4 -10mm,贴于处理过的干净载玻片上,37°C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。

石蜡包埋:

保存于4°C 70%乙醇中的组织样品

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80%乙醇 15 min

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95%乙醇 15 min

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100%乙醇 15min ´ 2

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1/2乙醇1/2二甲苯 15 min

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二甲苯透明 5-10 min

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1/2二甲苯1/2石蜡 30 min

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石蜡(1) 1.5hr

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石蜡(2) 1.5-2.5hr

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石蜡(3) 包埋

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RT保存

3、石蜡组织切片的免疫组化方法:

密封保存于RT的组织切片

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二甲苯(1) 20 min

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二甲苯(2) 20 min

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100%乙醇 20min

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95%乙醇 10 min

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80%乙醇 10 min

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通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈

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切片在PBS中浸泡 5 min*2

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0.4%Tritonx RT 10 min

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切片在PBS中浸泡 5 min*3

3%H2O2 RT10min

切片在PBS中浸泡 5 min*3

0.25%胰酶RT10min

切片在PBS中浸泡 5 min*3

Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS)RT 60min

倾去blocking buffer,勿洗

一抗4°C overnight in blocking buffer

取出切片复温1h,切片在PBS中浸泡 5 min*3

二抗in blocking buffer GAR1:200 (GAM1:100),RT 1h

切片在PBS中浸泡 5 min*3

DAB显色5-10min(50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2)

如果是增强型DAB只要1min即可。

切片浸入PBS终止显色,HE衬染1s,

玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15min,肉眼看到淡淡的紫色即可停止。

若颜色太深,可用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1~2秒钟(或更久)

脱水85%乙醇 5 min

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95%乙醇 5 min

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无水乙醇 5 min

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无水乙醇 5min

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二甲苯(1) 10min

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二甲苯(2) 10min

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中性树胶封片,室温干燥保存

4、石蜡组织切片的免疫荧光方法:

密封保存于RT的组织切片

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二甲苯(1) 20 min

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二甲苯(2) 20 min

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100%乙醇 20min

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95%乙醇 10 min

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80%乙醇 10 min

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通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈

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切片在PBS中浸泡 5 min*2

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0.4%Tritonx RT 10 min

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切片在PBS中浸泡 5 min*3

切片在PBS中浸泡 5 min*3

0.25%胰酶RT10min

切片在PBS中浸泡 5 min*3

Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS)RT 60min

倾去blocking buffer,勿洗

一抗4°C overnight in blocking buffer

取出切片复温1h,切片在PBS中浸泡 5 min*3

荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1:1000,GAM-488 1:1000RT 1h

DAPI(1:1000请根据二抗说明稀释二抗)

切片在PBS中浸泡 5 min*3

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